NodeJS + Не удается прочитать запрос свойства undefined

Попробуйте поместить код, который подключается к базе данных, до того, как вы укажете маршрут пользователя user.js:

    // view engine setup
app.set('views', path.join(__dirname, 'views'));
app.set('view engine', 'pug');
app.use(bodyParser.json());
app.use(bodyParser.urlencoded({ extended: false }));
app.use(logger('dev'));
app.use(express.json());
app.use(express.urlencoded({ extended: false }));
app.use(cookieParser());
app.use(express.static(path.join(__dirname, 'public')));

//Database connection
app.use(function(req, res, next){
  console.log('In');
    res.locals.connection = mysql.createConnection({
        host     : '127.0.0.1',
        user     : 'root',
      password : 'q1w2e3r4t5',
        database : 'users'
    });
    res.locals.connection.connect();
  console.log('out');
    next();
});


app.use('/', indexRouter);
app.use('/api/v1/users', usersRouter);

// catch 404 and forward to error handler
app.use(function(req, res, next) {
  next(createError(404));
});



// error handler
app.use(function(err, req, res, next) {
  // set locals, only providing error in development
  res.locals.message = err.message;
  res.locals.error = req.app.get('env') === 'development' ? err : {};

  // render the error page
  res.status(err.status || 500);
  res.render('error');
});

module.exports = app;
var server = http.createServer(app);
server.listen(4001);

Способ, которым вы пытаетесь использовать это, является промежуточным программным обеспечением. Это означает, что каждый раз при вызове api будет создано новое соединение с базой данных. Это приведет к большому количеству подключений к базе данных при наличии большого количества параллельных запросов. В идеале вам нужно создать только одно соединение и использовать его во всем приложении.

создать новый файл dbconnection.js

//create connection    
let connection = mysql.createConnection({
        host     : '127.0.0.1',
        user     : 'root',
        password : 'q1w2e3r4t5',
        database : 'users'
});
//export connection, you can optionally use 
//connection.connect here. The same state of this module is passed everywhere. 
exports.connection = connection;

сейчас в вашем app.js, импортировать его с помощью var connection = require('./dbconnection'); это автоматически создаст соединение.

Теперь вы можете использовать свое промежуточное программное обеспечение для установки соединения в res.locals, но не забудьте использовать его перед вашим файлом маршрутов.

app.use(function(req, res, next){
  console.log('In');
  res.locals.connection = connection
  console.log('out');
  next();
});

...

app.use('/', indexRouter);
app.use('/api/v1/users', usersRouter);

Это должно выполнить работу.